UHPLC 概述

如何在不犧牲分離效果的情況下增加速度,一直是 HPLC 效能改善的首要考量。由 van Deemter 方程式推測得知,管柱中填充的分子越小,樣品的產量及分離效果越高。然而,管柱中 的分子變小,意味著系統壓力需提高。從 1970 年代至 2004 年,因為 HPLC 的系統能提供的壓 力最多只有 6000 psi,其效能便會受到限制。這樣的壓力限制,只允許管柱中最小填充 3 µm 以上的分子,HPLC 的運作速度及分離效能亦無法很高。

1990 年中期,Dr. James Jorgensen 及其同事的先驅研究發現,在非常高的系統壓力下管柱填充 分子大小 2 μm 之無孔矽分子時,仍可達到非常好的分離效能及很快的分離速度。此即 ultrahigh-performance LC (UHPLC) 技術的開始。2004 年,Waters 公司推出首台 UHPLC 系統,稱 為 Acquity UltraPerformance Liquid Chromatography (UPLC),可在管柱填充 2 µm 的小分子 條件下,系統仍可加壓至 15,000 psi。

使用小分子填充管柱有幾個好處。因填充小分子可提供較好的分離結果級較高的靈敏度,此層析 儀的的解析度便提高了。相較於 5 µm 分子,填充 2 µm 的小分子在管柱中可增加約 70% 的解 析度及 3 倍的效率,故成為快速分析複雜化合物的理想方法。填充小分子亦可使分析時間縮短, 可用較高流速或較短管柱來分析。事實上,使用較短的管柱可以達到 10 倍的分析速度並提高樣 品的產量。使用 2 µm 分子來填充管柱尚有其他好處:

  • 因圖譜的波峯較高較窄,靈敏度會提高
  • 只要使用同種管柱類型,可將標準的 HPLC 方法直接用在 UHPLC 上
  • 沖提液的消耗較少,因為平衡及操作的時間降低了

水中污染物質對 UHPLC 可能的影響

會影響 HPLC 的水中污染物質亦會影響 UHPLC,但通常對 UHPLC 的影響程度更大。

顆粒 (particles)

對於管柱填充較小分子的 UHPLC,或管柱直徑較小、流速較高的 UHPLC,水中顆粒污染物質的 影響較大。相較於 HPLC,若 UHPLC 管柱中有小分子的顆粒污染物,管柱被阻塞的機率較大。

有機物質污染物

超純水中若含有有機污染物質,可能會對層析分離造成以下數種影響:

  • 有機物分子可能會堆積於層析管柱的表面,而減慢樣品及溶劑分子結合在膠體上面的速度。這可 能會影響層析的結果,降低解析度,甚至縮短管柱的壽命。
  • 沖提液配製的過程中若有有機物質的污染,這些有機物質可能會與樣品分子競爭,而結合在層析 膠體上的活性基團。結果會使注射樣品的過程中能結合上去的樣品分子變少,沖提時被釋出的樣 品分子亦會變少。因此,若層析法使用的溶劑中有有機污染物質的污染,此方法的靈敏度會降低。
  • 有機物質污染物可能會在管柱的上端堆積,並被沖提成為污染峯 (ghost peaks)。若有機污染物質 的量很大,這些有機物甚至會扮演新固定相 (stationary phase) 的角色,造成滯留時間 (retention time) 位移,訊號峯拖尾等等現象。管柱中有機物的堆積亦會造成背壓升高。
  • 基於這些因素,精確偵測 HPLC 應用所使用的超純水,其內所含有機物質含量,是很重要的。這 項測量可以用線上 TOC 偵測儀達成。

膠體 (colloids)

膠體可能會不可逆的吸附在固定相上,而影響管柱分離的效果。

細菌

細菌可能會堵住管柱並釋放出有機副產物,造成前述有機物質污染物對層析分離的影響。

離子污染物

離子污染物質亦會影響層析的分離。溶液中離子強度若改變,分離的結果可能會受影響,若污染的 離子會吸收紫外光 (例如硝酸根離子),會產生訊號峯而干擾結果的分析。若使用質譜儀偵測,上述 污染物產生的化合物會使數據分析變得很困難。

其他種類的污染來源

  • 超純水的儲存

超純水的儲存需考量純水儲槽的材質是否容易溶進水中,例如塑膠材質的容器經過一段時間,可 能會釋出有機物質和離子,玻璃容器不會釋出那麼多有機物質,但會溶出離子至水中。另外,超 純水的儲存過程中有時亦會促進細菌的生長。

  • 添加物

添加物如 trifluoracetic acid (TFA),常被加入 LC-MS 的溶劑中,以加強離子化的效果。配製緩 衝液的鹽類亦常被添加。欲將污染可能降至最低,配製溶劑時應選擇最佳品質的試藥。

選擇適當的超純水系統做為 UHPLC 分析用水

Merck Millipore 有數種產品與方案,能滿足您 UHPLC 實驗應用的需求,不論是 Milli-Q Integral、 Milli-Q Advantage、Milli-Q Reference 或 Synergy UV 等機型,皆有完整的純化單元及線上污染 物質偵測,能有效去除會影響 UHPLC 實驗的污染物質,符合您實驗低背景值、低污染峯、結果準 確的需求。

如何選擇適當的超純水系統做為 UHPLC 的分析應用? 有幾個因素需要考量 :

  • 分析方法
  • 實驗室分析方法所需用水量
  • 分析方法的偵測極限 (detection limits)
  • 純水系統需做確效與否
  • 實驗室純水系統的供水來源
  • 實驗室日常所需純水及超純水用量
  • 實驗室可擺放純水機台的空間
  • 線上即時監控系統: 確保純水品質保持在正常規格範圍內
  • 實驗室中是否有其他需要用超純水進行分析的實驗
  • 實驗室將來可能的擴展或升級

1. 資料來源: http://www.merckmillipore.com/

1

電子報下載

')}