生物實驗對水質的要求

對生物而言,水是不可或缺的物質,這是因為生物體內大多數的反應都需要水分子的參 與。超純水可用於液體培養基的配製、各種酵素的緩衝液,或者作為分子間相互作用的反應 液。當我們進行試管內 (in vitro) 反應時,如何盡可能的與體內反應一致是非常重要的,若 混入與體內反應不同的干擾物質,便可能造成反應速率的抑制,因此對這些不需要的干擾物 質,必須予以去除。

如果以不同水質的超純水來配製無血清培養基以培養神經幹細胞,結果如圖 1 所示。 使用經超濾膜與紫外線照射處理的超純水所培養的神經幹細胞,可以生長延伸為良好的樹 突狀細胞型態,而使用未經超濾膜與紫外線照射的超純水所培養的神經幹細胞,則呈圓形, 表示細胞生長受到抑制作用。

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RNA 實驗對水質的要求

1) 使用 DEPC 來去除 RNase 的利弊得失

使用無 RNase 的超純水來進行原位雜交 (in situ hybridization), 並與 DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) 處理過的水來作比較 (所謂 DEPC 處理,是傳統去除 RNase 水的製作方法。 這是在純水中加入 0.1% (v/v) 的 DEPC,經數小時的攪拌使 RNase 失去活性,之後再以高 壓滅菌鍋來分解殘留的 DEPC),分析結果發現,二種水質所得的結果相同。

但是由於 DEPC 處理過程相當耗費時間,降低了原位雜交 (in situ bybridization) 實驗的效率。並且,有報告指出 DEPC 有致癌性,應避免使用。同時 DEPC 屬於強化學修飾劑,高溫 高壓處理後仍有殘留的可能性,會對其它的酵素活性產生抑制。

透過 RNA stability test 亦可比較不同水質處理對 RNA 實驗的影響。RNA stability test 是 經由不同 RNA 樣品處理以抑制 RNase 活性後,比較 rRNA 含量的變化。此實驗使用生物偵測 器 (bioanalyzer) 中的 agarose gel 微電泳,rRNA (含 18S 及 28S bands) 再經由螢光偵測 RNA 峯的強度 (圖 2) 並模擬出類似 RNA 電泳的結果 (圖 3)。

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三樣品 (DEPC 處理, 超過濾膜 UF 處理, 市售 RNase-free water) 分別於 37℃ 放置 1 hr 及 24 hr,RNA 的分解可因 RNA 片段大小的分佈變化及 rRNA 螢光偵測峯的減弱輕易觀察得。實 驗結果得知,超過濾膜 (UF) 處理的純水,其中的 RNA 穩定性較 DEPC 處理的純水高 (圖 2)。可 能的原因有二: 第一,DEPC 雖會抑制 RNase 活性,但會增加水中有機物及 bicarbonate 的濃度, 此現象不但使比阻抗值大幅下降,亦會改變 pH 值,進而降低 RNA 的穩定性。然而,超過濾膜 (UF) 處理的純水不影響水的品質,RNA 因此較穩定 (圖 2)。第二種可能性為,DEPC 處理的純水 中,RNase 可能隨著時間恢復部分活性,並緩慢降解樣品中的 RNA。這種現象不會在超過濾膜 (UF) 處理的樣品中發生,因 RNase 已於水中完全被去除了。

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近來,在生物學與分子生物學領域中經常使用 LC/MS、HPLC 與 DNA 晶片等儀器進行分 析檢測,因此需要使用不含內毒素、RNase 而且有機物含量極低的超純水。DEPC 水雖然不含 有 RNase,但含有許多 DEPC 分解後所產生的離子與有機物質,將對水質造成不良影響。因此, 使用具有超濾膜與紫外燈的超純水系統,所生產的不含內毒素,不含RNase 超純水,對於生物 實驗而言是一項趨勢 (圖 4)。

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在生產 RNase-free 純水時,可通過在超純水系統中安裝超濾膜來精製。在預處理中應使 污染物的濃度盡可能的降低,然後在超純水裝置中設置超濾膜,就可有效地去除分子量在 10,000 ~30,000 Dalton 的 RNase。

實驗時使用隨取隨用的 RNase-free 超純水,就能避免使用 DEPC 處理而導致對實驗的不 利影響。

在 RNase-free 的條件下,比較了兩種水質 (經過超濾膜和紫外燈照射的超純水和蒸餾水) 對實驗的影響 (圖 5)。實驗結果可見:與超純水相比,使用蒸餾水的實驗結果訊號強度相對較 弱。在 RNA 實驗中,有可能會由於試劑和水的存放引起 RNase 的污染,所以請務必對 RNasefree的純水以隨取隨用方式使用。同時,取水的環境也要考慮到是否會造成另外的污染。

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2) 比較在不同水質的緩衝液狀態下,對 RNA 電泳實驗的影響 (1)

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比較在不同水質的緩衝液狀態下,對 RNA 電泳實驗的影響 (2)

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3) 比較在不同水質的緩衝液狀態下,DNA 電泳實驗的影響

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4) 比較在不同水質的緩衝液狀態下,對 Western blotting 的呈色影響

1. 水質的好壞的確影響了 RNA 或 DNA 電泳實驗的結果。

– 水質越接近超純水,電泳實驗呈現出的螢光訊號越強

– 經超過濾膜 (UF) 處理過之超純水做出的電泳表現出的螢光訊號最強,背景值的雜訊也最低

2. 顯然的,一般 RO 純水或去離子水中仍有許多污染物質,造成背景的螢光雜訊,影響 RNA 或 DNA 電泳實驗的品質好壞。

3. 建議在做電泳實驗時, 配製緩衝液的超純水需徹底排除有機物及核酸分解酶 (Nuclease) 的 污染,可以採用超高濾膜 (UF) 做進一步處理。

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– 為顯現出蛋白質,Western blotting 最後會以呈色 方式 (酵素呈色或螢光呈色方式) 來作表現

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超純水經過超過濾膜 (UF) 處理過後,能有效去除掉會干擾呈色酵素的污染物質,例如:HRP 的活性會被內毒素抑制,而細菌本身也會產生污染性的鹼性磷酸酶 (AP, Alkaline phosphatase), 如果在超純水系統中使用具有蛋白質攔截能力 (MWCO) 超過濾膜,來去除掉 endotoxin 或 AP 則 是最好的選擇,使背景值的雜訊不致影響本身的訊號強度,由上圖可知,以 Milli-Q 超純水作出呈 色反應,每條 Band 表現出的相對訊號都比較強。

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– 超純水經過超過濾膜 (UF) 處理過後,已去除掉水中的小分子有機物,這些有機物會吸收 UV 光,造成實驗上背景雜訊。

– 由上圖可看出,使用處理過的超純水相對於一般瓶裝純水,每一條 Band 的螢光相對強對較高。

結論:

– 酵素呈色反應通常以 HRP (Horse radish peroxidase) 或鹼性磷酸酶 (AP, Alkaline phospha- tase) 結合在抗體上,再外加呈色劑作為受質 (Substrate) 與酵素反應,所表現出的顏色變化來 推斷待測物質的量。

– 螢光呈色則是以抗體上接著螢光物質,以螢光表現量來推定待測物質的多寡。

– 不論以何種呈色反應,所需要的水必須為 Type 1 的超純水,且此超純水必須去除 AP 或 HRP 酵素、有機物以及細菌的污染。

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  • 可產生不含細菌 (<1 cfu/mL) 的超純水
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1 資料來源: 超純水及其實驗室應用,Merck Millipore,P. 56-62

2 資料來源: http://www.millipore.com/catalogue/ module/c8121#0

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